高速道路を使わない日本最長の路線バスは、奈良交通で運行している八木新宮線の「八木新宮特急バス」になります。奈良県の大和八木駅と和歌山県の新宮駅を結ぶ路線で、路線距離は166.9km、バス停の数は166（昔は167だったので、１つ減ったようです）、運行時間は約6時間30分です。もちろん、バスの運転手も休憩が必要となりますので、途中の3カ所で休憩停車があります。

全区間乗り通すと運賃は片道で大人1人5250円。また、2日間有効で、五條バスセンター・五条駅から権現前の区間で途中下車可能な「168バスハイク乗車券」も発売されています。値段は同じく5250円。ただし、逆方向に戻ることはできません。
ちなみに「168」は、バスが走る国道168号線から名付けられているようです。

東京23区内だったら、新宿駅西口と王子駅前を結ぶ都バスの「王78系統」だと思うのですが、それよりも長い路線は、確か近畿地方のほうにあると聞いたことがあります。

北海道・釧路の市立病院前と羅臼を走る阿寒バスの「釧路羅臼線」も、距離としては長いほうではないでしょうか？　走行距離165.9kmで、所要時間は約3時間50分ですので。